Feliz Navidad

Se que hace casi un año que no escribo absolutamente nada, pero bueno.... Mi felicitación anual es cada vez más ridícula así que... xD

Estudiar tu debes

Estudiar tu debes...

...si aprobar quieres

O... Yoda se saca las oposiciones

Love is Truth

Merry Christmas

Merry Christmas and a Happy New Year :D

The Last Universal Common Metabolism (I)

Trabajo basado en: How Did LUCA make a living?: Chemiosomosis of the origin of life

¿Qué es la vida? La vida, según la definición de la NASA, corresponde a un sistema químico autosuficiente, capaz de experimentar una evolución de tipo darwinista. El estudio del Origen de la Vida ha sido un interrogante desde hace largos años con el objetivo de comprender de qué estaba compuesto LUCA (The Last Universal Common Ancester) y dónde y cómo pudo surgir. Con este objetivo, se han desarrollado diferentes teorías a lo largo de los años aunque todas coinciden en tres puntos esenciales: LUCA necesitaba una estructura, un metabolismo y una información que se pudiera transmitir.

Además, hay dos enfoques clásicos: el RNA primordial y el metabolismo primordial. Estas teorías colocan al RNA como primer escalón a la vida o a un metabolismo que partió de reacciones sencillas y que se fue complicando con el tiempo, respectivamente. Este trabajo acerca del metabolismo primordial podemos englobarlo dentro del segundo grupo de teorías ya que, con diferentes argumentos, colocan a la quimiosmosis como primer metabolismo alrededor del que surge la primera célula.

The Last Universal Common Metabolism: de lo inorgánico a la vida.

En este trabajo se habla acerca de la importancia de la quimiosmosis, es decir, el movimiento de iones a través de una membrana gracias a un gradiente de protones. Gracias a diferentes evidencias, que serán expuestas a continuación, este intercambio iónico es colocado como el metabolismo primordial e inherente de la primera célula, cosa que se refleja en su universalidad en la vida actual. Este planteamiento se basa en la teoría de Wächstershäuser y la posterior de Hall, Russell y Martín en las que el escenario del origen de la vida está ligado a las surgencias hidrotermales submarinas de carácter alcalino.

Si se emplaza el origen de la vida en estas fuentes hidrotermales,  se subsanan los problemas de la sopa primordial (Miller 1953) basada en las teorías de Oparin. Esto es debido a la poca concentración de los componentes en el mar ancestral por lo que la formación espontánea de moléculas estables es difícil. Por otra parte, la radiación UV, fuente de energía de Oparin y Miller, además de provocar la formación de polímeros también produce su destrucción de forma que no podría aumentar la concentración que daría lugar a moléculas más complejas.

Por otra parte, es necesario que las surgencias sean de carácter alcalino porque las llamadas fumarolas negras tienen un pH demasiado bajo y unas temperaturas demasiado altas como para permitir el desarrollo de la primera vida. Las surgencias hidrotermales alcalinas son un buen escenario ya que el agua emerge desde la corteza terrestre cargada de iones gracias al proceso de serpentinización. Este proceso consiste en la filtración del agua, que, debido a las altas temperaturas de las capas más bajas de la corteza, capta moléculas inorgánicas y sale por estas fuentes hidrotermales. Cuando el agua caliente entra en contacto con el agua del océano, algo menos caliente y con un pH diferente, se produce la sedimentación de algunos minerales (Bartolo Luque et al. 2009).

Por lo tanto, gracias a las temperaturas moderadamente altas, pH alcalino, gran cantidad de moléculas inorgánicas (H₂, CH₄, HS^-, FeS, HCN, CO₂, NH₃,…) y pequeñas microcavidades de FeS (pirita), que permitían la concentración de las moléculas que se forman debido a reacciones inorgánicas favorables; se cree que pueden ser el emplazamiento del origen de la vida.  Estas microcavidades, encontradas en Lost City, pudieron formarse junto con aragonita y servir de membrana inorgánica a las primeras protocélulas como explicaremos más tarde.

El principal inconveniente de las surgencias hidrotermales alcalinas se basa en la baja concentración de moléculas que no están presentes pero que son muy importantes para la vida como el fósforo, el magnesio o el zinc. Como solución a este problema se planteó el trasladar el escenario hidrotermal submarino a uno en superficie que contara con estos iones importantes. Además, aunque la radiación UV puede suponer un problema,  la presencia de compuestos metálicos como el hierro, ayuda a la protección (Jesús Page 2012).

Fuera submarina o no, para explicar el origen de la quimiosmosis, es muy importante el pH alcalino porque ayuda a establecer un gradiente de concentración de protones. Este gradiente de concentración es posible gracias a que la atmósfera primitiva era muy reductora y con gran concentración de CO₂ que se disolvía en el océano, dándole un carácter ácido. Esto hizo posible el gradiente de protones, desde el océano al interior de las microcavidades, gracias al que la quimiosmosis es posible.  Los gradientes van siempre asociados a membrana en la actualidad, por lo que en LUCA, al no tener, tuvo que acoplarlo a las paredes inorgánicas de las microcavidades. Además, gracias al gradiente de protones y a la presencia de H₂ y CO₂ en las surgencias hidrotermales alcalinas, se podían llevar a cabo procesos de metanogénesis y acetogénesis (o unos muy similares) no acoplados a ATP. Los compuestos de un solo carbono son y eran esenciales para el inicio de estos procesos y se producían gracias a la serpentinización explicada previamente (William et al. 2008).

A pesar de que aún no existía la vida como tal, una vez generadas las primeras moléculas tuvo que haber una evolución prebiótica mediada por una selección natural de tipo termodinámico. En esta evolución, las reacciones más favorables y los compuestos más estables prevalecieron frente a los más inestables y con reacciones más improbables.

Los procesos de metanogénesis eran capaces de producir acetiltioésteres capaces de almacenar cierta cantidad de energía que se incrementaba en combinación con el fosfato. Estas moléculas fueron previas al ATP y pudieron poner en marcha el metabolismo primordial. Además, como explica en el texto, los enlaces tioester pueden ser transformados fácilmente en enlaces fosfato como los del ATP. Por lo tanto, los nucleótidos debieron surgir como moléculas estables de almacenaje de energía y de forma azarosa condujeron a la unión para formar ATP (Robert Saphiro 2007). A continuación exploraremos este punto.

Sabemos que el ATP finalmente se acopló a la quimiosmosis, debido a que, tanto en bacterias como en arqueas, encontramos quimiosmosis. Además, las membranas son totalmente diferentes, el sistema de manejo del material genético es similar pero presenta proteínas distintas y las ATPasas son de distintos tipos. Por lo tanto, el mecanismo quimiosmótico tuvo que ser previo a todo esto. Sin embargo, existe una proteína común a todos los organismos: el receptor SRP del retículo endoplasmático rugoso.

Esto entra en conflicto con la anterior información ya que es una proteína de membrana. Pero si consideramos que esta proteína viene de la transcripción y traducción de un RNA mensajero, es necesario que haya material genético previamente. Esto es respaldado por el hecho de que no existe ningún mecanismo conocido capaz de transformar las proteínas en información genética, es decir, una especie de retrotranscripción proteica (Jesús Page 2012). Más tarde volveremos sobre esta cuestión.

La presencia de ATP gracias a la quimiosmosis, es decir, gracias a un gradiente de protones; en lugar de ATP (u otras moléculas energéticas) generados gracias a fosforilaciones ligadas a sustrato; supuso una ventaja para la célula primordial ya que la permitía crecer.

Estos argumentos dejan de lado a la fermentación que, durante mucho tiempo, fue el principal candidato a primer metabolismo dado que cuando la vida emergió, había poco o nada de oxígeno. Sin embargo, la fermentación es un proceso muy complicado como para haber sido el primero, además de que, tanto en bacterias como en arqueas, los elementos implicados son muy diferentes. Por lo tanto, la fermentación tuvo que ser un elemento que surgió dos veces en la línea evolutiva. 

Continuará....

BIBLIOGRAFÍA

• Álvaro Giménez Cañete, Javier Gómez-Elvira, Daniel Martín Mayorga (2011); Astrobiología: Sobre el origen y evolución de la vida en el Universo; Colección Divulgación Editorial Catarata; Capítulo 4; 105-138
• Bartolo Luque, Fernando Ballesteros, Álvaro Márquez, María González, Aida Agea, Luisa Lara (2009); Astrobiología: un puente entre el Big Bang y la vida. Editorial Akal; Apartado 8 y 9; 171-205
• David F. Blake y Peter Jenniskens (2001); Hielo y el Origen de la Vida; Investigación y Ciencia; Monográfico 52;  12-17)
• James P. Ferris (2006); Montmorillonite-catalysed formation of RNA oligomers: the possible role of catalysis in the origins of life; Philosophical Transactions of the Royal Society; 361; 1777-1786
• Jesús Page (2012). Origen y Evolución Celular. UAM
• Robert M. Hazen (2007); El origen mineral de la vida; Investigación y Ciencia; Monográfico 52: 18-25
• Robert Saphiro (2007); La aparición repentina de una macromolécula autorreplicante como el ARN era extremadamente improbable. Los iniciadores de la vida habrían sido entramados de reacciones químicas impulsados por una fuente de energía; Investigación y Ciencia; Monográfico 52; 5-11
• William Martin, John Baross, Deborah Kelley and Michael J. Russell (2008); Hydrotermal vents and the origin of life; Nature Reviews; 6; 805-814

The Last Universal Common Metabolism by María Pilar Vesga Aguado is licensed under a Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported License.

Creado a partir de la obra en www.asomatealventanal.blogspot.com.

Orquesta por la Cultura 12m Madrid Sol

Hoy, cuando iba a la manifestación de Sol por el 12M, no me imaginaba que me iba a encontrar esto. Un ambiente totalmente festivo y reivindicativo. Una gran convocatoria, no cabía la gente en la plaza.

Creo que el video que he grabado no se oye muy bien, pero bueno, la imagen es lo que cuenta. A ver si esta vez nos oyen bien

Transgénesis de sitio específico mediada por integrasas vía inyección pronuclear

He aquí mi resumen sobre el trabajo original Tasic B, et al. (2011) Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proc Natl. No he incluído los dibujos del trabajo por razones obvias. Enjoy it

TRANSGENESIS DE SITIO ESPECÍFICO MEDIADA POR INTEGRASAS VÍA INYECCIÓN PRONUCLEAR

1.- Introducción

Durante muchos años se ha llevado a cabo la producción de ratones transgénicos mediante inyección pronuclear. Esto consiste en la fecundación de un óvulo por un espermatozoide de forma que se obtiene un cigoto con dos pronúcleos. Mediante microinyección se le introduce el DNA de interés al pronúcleo masculino (más grande) y se inserta en una hembra pseudopreñada.

Mediante un Southern Blot o una PCR, podemos detectar en la descendencia aquellos individuos que han incorporado el fragmento. Sin embargo, no siempre lo incorporan en todas las células si no que puede existir una inserción tardía del fragmento de forma que sólo lo presenten algunas células del individuo adulto. Cuando lo haya incorporado en la línea germinal habrá que cruzarlo con la F0 y, posteriormente su descendencia, con los individuos de la F1 para obtener algunos individuos homocigotos para este transgen.  

Sin embargo, con esta técnica pueden surgir problemas con el efecto de posición, además, de que es muy poco eficiente. El efecto de posición es la situación en la que la expresión fenotípica de un gen se altera al cambiar la posición en el genoma (2), en este caso, debido a la introducción del material exógeno.

Debido a esto, como resultado, pueden obtenerse ratones cuyo fenotipo no es el que deseamos porque el gen de interés ha podido insertarse en cualquier lugar del genoma de forma que los datos obtenidos pueden estar condicionados por efectos inesperados de la inserción.

Para abordar el problema de la inserción aleatoria del gen, es necesaria la recombinación homóloga con un lugar específico del genoma. Sin embargo, la eficiencia de este proceso, es realmente baja.  Una solución para este problema son las integrasas, unas enzimas que insertan un gen en un lugar determinado de un sistema heterólogo. Esta propiedad ha sido clave para este estudio donde se ha empleado la integrasa del fago φ31 que reconoce sitios attP previamente insertados en el genoma del huésped.

2.- Desarrollo del experimento

La integración específica de sitio tiene como base teórica la inserción del fago λ en el genoma del huésped a partir de los sitios att lo que implica una recombinación sin que sea necesaria la presencia de secuencias homólogas. Para ello es necesario que en el huésped tengamos un sitio attB y en el fago un sitio attP de forma que la integrasa pueda reconocerlos y actuar de una forma muy similar a la de la topoisomerasa. (3)

En este experimento se usa la integrasa del fago φ31 por lo que es necesario generar embriones que contengan sitios attP. Para ello, se utiliza la recombinación clásica en células ES de ratón. Las células ES son células madre obtenidas del blastocisto de un ratón que van a ser transfectados e insertados en una hembra pseudopreñada. Después, habrá que realizar cruzamientos para obtener los individuos homocigótos para estos sitios attP.

Los experimentos se realizaron con una única copia de attP o con tres aunque, a pesar de que en un principio pudiera parecer lo contrario, la eficiencia de inserción es aproximadamente igual en los dos tipos de embriones.

En el estudio se probaron dos sitios de inserción de estos sitios attP para la integración: Rosa26 e Hipp11. El sitio Rosa26 soporta la expresión de una sola copia de un gen Knock-in con un enhancer CMV (virus del mosaico de la coliflor) y un promotor ubicuo pCA (promotor de la β-actina de pollo). Por otra parte, H11 soporta alto nivel de expresión génica del promotor pCA y una alta tasa de recombinación mitótica comparado con Rosa26. Por lo tanto, se concluyó que H11 va a permitir un mejor acceso a la integrasa que Rosa 26 además de que Hipp11 soporta una mayor expresión de trangenes integrados. Los experimentos resultantes de la inserción de transgenes en este locus H11 no predicen la ruptura de ningún gen endógeno y resultan en ratones fértiles y sanos.

Una vez que se obtienen embriones homocigotos para attP, se realiza una coinyección de un miniDNA circular pcA-pattB-GFP (el GFP nos sirve como gen reportero) con un mRNAφ31o (mRNA de la integrasa optimizada para mamíferos) obteniendo una alta tase de inserción. Además, las inserciones en sitios aleatorios son muy raras y la inclusión de más de una copia es muy poco común. Por último, este método puede ser específico de tejido si le incluímos un promotor de dicho tejido. Por ejemplo, introdujeron Hb9 obteniendo unos resultados favorables.

Sin embargo, antes de llegar a esta conclusión se realizaron otros experimentos para determinar si el plásmido completo influía en la expresión del gen reportero y para averiguar si se obtenía la misma eficiencia insertando la integrasa específica en el genoma.

En cuanto al primero, se hicieron experimentos para observar si la introducción del esqueleto (backbone) del plásmido en los sitios específicos afectaba a la eficiencia de integración. Observaron que la eficiencia disminuía por lo que concluyeron que debían de utilizar sólo el miniDNA circular, preferentemente, o un DNA con el backbone pero con dos sitios attB para que sólo se integrara el fragmento de interés como vemos en la figura. En este último caso, la integrasa cataliza a una recombinasa para el intercambio del cassette de genes.

El segundo, se obtuvieron embriones homocigotos para Hipp11-attP3-NVφ (gen Hip11 con sitios attP, gen de resistencia a neomicina, promotor VASA de la expresión germinal y gen de la integrasa φ31o).  A estos embriones se les inyectó el microDNA circular attB-pCA-GFP obteniéndose como resultado que no había una buena tasa de integración. A continuación se coinyectó a estos embriones con mRNA φ31o aumentándose mucho dicha tasa. Esto se dedujo que debía deberse a que VASA no es un promotor suficientemente fuerte.  

Por lo tanto, se decidió eliminar el backbone del plásmido y el cassette NVφ del experimento ya que su presencia sólo dificultaba la integración y disminuía la tasa de inserción.

3.- Conclusiones

El hecho de que una vez que se obtienen individuos con sitios attP insertos en el lugar correcto, se puedan introducir fragmentos de DNA con una alta probabilidad, abre muchas puertas a la terapia génica e ingeniería genética. Esto es debido a que este método es, considerablemente, más sencillo y efectivo que la recombinación homóloga en células ES de ratón y la microinyección en pronúcleos para una recombinación aleatoria. 

No sólo implica la disminución del tiempo empleado en la obtención del transgénico deseado si no que supone una ventaja a nivel económico y ético. Esto es debido a que al tenerse que emplear menos individuos para obtener resultados favorables hay un ahorro económico en su obtención y mantenimiento y se sacrifican menos animales.

Las diferencias generadas en los niveles y patrones de expresión debido al efecto de posición y difererencias en el número de copias insertadas aleatoriamente, son eliminadas con este método de transgénesis específica.

Existen otros métodos modernos como por ejemplo el dedo de Zinc que crea sitios específicos de recombinación; y la utilización de la recombinasa Cre para catalizar el intercambio de cassettes de genes en el locus Rosa26.

Un desarrollo futuro podría usar dos parejas de attB y attP no compatibles para controlar la dirección de la inserción; o incluso plantear una inserción específica de varios fragmentos de DNA con varias funciones.

4.- Bibliografía

(1) Tasic B, et al. (2011) Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proc Natl

Acad Sci USA 108:7902–7907.

(2) Genética. Griffiths 7ª Edición. Pág 813 McGraw Hill

(3) Genes IX.  Capítulo 19. McGraw Hill